本期介绍限制性蛋白水解-质谱剖析技能（LiP-MS）的原理、技能流程和其在蛋白质-小分子相互效果研讨中的运用。

  说明小分子（包含内源性代谢物和外源性化合物）怎么发挥调控效果的核心问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互效果研讨。蛋白质与小分子的相互效果形式既有较安稳的共价结合，也有瞬时的弱相互效果。怎么活络、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互效果是剖析难点。现在，蛋白质-小分子相互效果的剖析战略大致可分为两类：一是靶向相互效果研讨，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互效果的小分子（或蛋白质）；二对错靶向相互效果研讨，全面辨认多种蛋白质-小分子的相互效果概括。运用的具有剖析技能包含：外表等离子体共振技能（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱剖析技能（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱剖析技能（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热搬迁剖析技能（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反响靶标安稳性剖析技能（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱剖析技能（LiP-MS）的原理、技能流程和其在蛋白质-小分子相互效果研讨中的运用。

  LiP-MS技能开始由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组树立

  ：运用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的改变，经蛋白酶切后构成差异肽段，液质联用剖析辨认和判定差异肽段，根据差异肽段估测蛋白质与小分子的相互效果位点。

  在非变性条件下提取蛋白，以保存蛋白活性和空间结构。先运用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互效果位点存在空间位阻，然后防止被蛋白酶K切开，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组剖析辨认和判定差异肽段，根据差异肽段所在方位猜测蛋白质与小分子的相互效果位点（图1）。

  可依据实践意图和细胞类型选不一样的细胞/安排裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/安排蛋白抽提，取得的细胞/安排全蛋白提取物可直接与方针小分子共孵育。

  现在多种类型的液相色谱-高分辩质谱联用仪均可用于蛋白质组学剖析，已运用于LiP-MS的高分辩质谱仪包含，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞翔时间质谱、轨迹阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。

  研讨人员根据LiP-MS技能在大肠杆菌中探究多种内源性代谢物和蛋白的相互效果形式

  ，先选用凝胶过滤法除掉大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，取得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的要害内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）别离共孵育。根据LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白产生潜在相互效果，其间1447个相互效果是初次发现的（图2B）。作者将所发现的相互效果与在线数据库BRENDA比照（首要触及酶的功用和代谢通路等信息），证明LiP-MS技能可以精确地辨认已报导的蛋白-内源性代谢物相互效果，假阳性率低于6 %。