答： 灵敏，可达ng级，用ECL显色法可达pg级。灵敏，相对便宜且特异性高。

  答：a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS的浓度，同时将样品煮沸时间延长，一般需96℃以上10-15min左右；

  答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜，此孵育条件比37℃1h要温和很多)，并提高封闭液浓度。

  答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。

  b) ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。

  答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；

  答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家通常用ECM。

  答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，能打开二聚体。

  答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为咱们提供简单的指示作用。)

  答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。

  14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和WB试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？

  答：a)免疫组化可拿来做定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择正真适合，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。

  b)两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明大多数都会说明能够直接进行什么实验，在免疫组化时，是不是适合石蜡切片或者冰冻切片。

  15、做WB时，提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂)，用了一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了一种一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

  b)样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WB过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂(PMSF在水溶液中不稳定，30min就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1小时，补加1次。见水易分解，使用前加入)。

  答：当然可以，有些甚至可以同时测几十种样品；有时如果抗体特异性高且效价高，同时使用2种一抗，可在一张膜上检测2种不同蛋白。

  答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。

  20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法能解决？

  答：你可以加大上样量，没问题，还有转移时你能够大大减少电流延长时间，加20％甲醇；还有一种办法是采用最新的WES来检测，灵敏度极高，但价格贵。

  21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？

  答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。

  答：可以浓缩样品，也能够准确的通过你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的，建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可优先考虑加大胶的厚度，以增大上样孔体积，可以试1.5mm厚的胶。

  答：-80℃，若没有反复取出冻融，保存一两年没问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

  24、我所测定的蛋白分子量是100KD左右，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

  答：上述提到的两种凝胶均能够正常的使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。

  25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

  答：不可以使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含较多的生物素，用BSA(5%、8%)代替会好一点。

  答：WB一般上样30-100μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话非常容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。

  答：一定要进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(12000转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，必须要格外注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

  答：做200KD蛋白的WB时要注意，分离胶最优选择7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少300mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知道怎么来分析问题)。

  答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了，但是不要超载。

  答：主要是一抗要选择好。对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

  答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称抗原表位)，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，蛋白煮后变性其构象会消失，仅剩下一级结构。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般我们做的时候没这么复杂的考虑，多看看抗体说明书所注明的实验范围来做，这样省时省力。

  答：所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

  答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

  答：肯定可以，建议先检查非磷酸化蛋白，然后使用抗体洗脱液将抗体洗去，再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。

  37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？

  答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有一定的概率会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。

  答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和免疫组化。

  答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜，不要整张膜孵育，费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议，仅供参考)。

  答：无特别的条件。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液；小编发现电泳时产热也很厉害，其实可以在电泳时加冰浴。

  答：没问题，就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点电泳液保持湿度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有问题，你能重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺；能够替换的试剂，尽量换一下，选用进口试剂。

  42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

  答：这么广的分布不好转移，一般建议：21KD和66KD可以一起转，一起做。采用12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，能够准确的通过你实验室师兄师姐的调节；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。

  答：可优先考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以有效的预防凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也还是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜(0.2μm)。

  44、我用的是可视Marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。Marker是新买的。

  答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择，现在已经有商用梯度胶了，大家可自行选择。

  答：能选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都能当成内参，动动手查查就可以选出你要的内参。(也可以私信小编哦)

  答：一般都会采用β-actin就可以，也能够正常的使用GAPDH，但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽可能地选择β-actin。

  48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

  答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持冰浴，保持低温。除非有文献特别指明一定要使用特殊方法，一般来说没有区别。

  49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST的T是Tween吗，浓度是多少？

  50、封闭，一抗，二抗时的温度有没什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?

  答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。小编建议尽量还是4℃过夜孵育，原因在上面已说明。

  答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要是通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

  52、怎么样才可以跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

  a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。

  b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。

  53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

  答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

  原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形，所以因为赶时间而加大电压有极大几率会出现这个)。

  原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

  ④选择的膜易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。

  ⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。

  ①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身能出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。

  ③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。

  ①你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性，同时查阅文献。

  ③转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

  ④抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其能否交叉识别测试种属的对应蛋白。

  ⑦洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

  ①膜上多处出现黑点或黑斑，原因有2点，抗体与封闭试剂发生非特异性的结合；或者配的奶粉没有充分溶解，奶粉团粘在膜上而没洗干净。

  ③蛋白分子量偏低或偏高，原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

  爱护身体，保护自身。安全第一，实验第二。安全无小事！操作有毒试剂时，一要定带手套和口罩，且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。

  以上为本期内容。简单地为大家提供一些建议，希望我们大家的实验能顺顺利利，早日完成SCI大业!